Enzyme à mécanisme Ping-Pong : la NDP kinase
La nucléoside diphosphate kinase (NDPK) catalyse le transfert d'un groupe phosphate de l'ATP vers un nucléoside diphosphate (NDP), selon le mécanisme équilibré ci-dessous. Les études de cinétique à l'état quasi stationnaire ont démontré que le mécanisme était du type ping-pong, avec un intermédiaire phosphorylé sur une histidine. L'enzyme se présente sous forme tri ou hexamérique selon sa source.
Différentes formes de la NDPK provenant de Dictyostelium discoidium ont été déterminées par l'équipe de J.Janin à Gif sur Yvette. Les structures ci-dessous correspondent à celle du monomère. La structure de l'enzyme libre (non montrée) contient un feuillet b central constitué de 4 brins anti-parallèles. Sa forme phosphorylée identique à la précédente est phosphorylée sur l'histidine 122
Le site de fixation de l'ADP (et donc potentiellement de l'ATP) est le même que celui du GDP (l'un des substrats majeurs sur le plan physiologique). Les 2 phosphates sont enfouis dans le site, tournés vers l'H122, tandis que la base est située relativement en périphérie du site.
La compréhension du mécanisme ping-pong est donc évidente: l'ATP (un tri nucléotide) se fixe en premier , puis transfère son groupe phosphate à l'His122. Il libère ensuite le site, qui peut alors être occupé par un di nucléotide (comme le GDP) qui est alors phosphorylé. La réaction est bien entendu équilibrée, l'occupation du site nucléotide par l'un ou l'autre des réactifs (ATP, ADP, GTP, GDP ...) dépendant alors de leur concentration relative et de l'affinité de chaque composé pour le site unique.
Un aspect intéressant de ce mécanisme est de comprendre le rôle de l'H122. Est-il uniquement de positionner le groupement phosphate au dinucléotide ou y a-t-il également une activation. Pour cela, une NDPK mutante H122G a été réalisée. La vitesse de la réaction de transfert de phosphate de l'ATP vers l'eau (en absence de tout autre substrat) ou vers l'imidazole (un autre nucléophile) a été mesurée. Le rapport kcat/Km est dans l'ordre suivant :
| Enzyme/substrat |
kcat/Km (M-1.s-1) |
| NDPK sauvage/H122 |
2.106 |
| NDPK H122G/Im |
4.104 |
| NDPK H122G/Eau |
1.103 |
| pas d'enzyme/Im |
4.10-9 |
L'expérience avec le mutant H122G est faite avec l'enzyme à environ 75nM, et en présence seulement d'eau ou d'une concentration 60 mM en imidazole. L'enzyme H122G catalyse l'hydrolyse de l'ATP, mais un excès d'imidazole remplit le site catalytique et multiplie la qualité globale de l'enzyme d'un facteur 40. L'enzyme native, avec le cycle imidazole de l'H122 dans la structure est cependant 50 fois plus efficace que le mutant en présence d'imidazole. Par ailleurs, l'enzyme mutante catalyse le transfert de phosphate de l'ATP vers l'imidazole environ 1013 fois par rapport à ce qui se passe sans enzyme (cf dernière ligne du tableau ci-dessus).
Visualisation 
avec Chemscape Chime
Pour en savoir plus:
- Morera S, Chiadmi M, LeBras G, Lascu I, Janin J. (1995) Biochemistry 34, 11062-70
- Y.W.Xu, S.Morera, J.Janin & J.Cherfils, (1997) PNAS 94, 3579-3583.
- L.Cervoni, Y.Lascu, Y.W.Xu, P.Gonin, M.Morr, M.Merouani, J.Janin & A.Giartosio, (2001) Biochemistry 40, 4083-4589.
