GAL4
Les interactions entre deux protéines ont généralement été étudiées en utilisant des techniques biochimiques, comme la co-immunoprécipitation, le fractionnement par chromatographie, la SRP, Overlay.
Un autre système génétique étudie ces interactions tirant profit des propriétés de la protéine GAL4 de la levure Saccharomyces Cerevisiae. Cette protéine GAL4 active la transcription des gènes GAL1 et GAL10 nécessaire à l'utilisation du galactose par le levure (1).
Structure de GAL4
La protéine GAL4 est constituée de deux domaines :
- un domaine N-terminal qui lie spécifiquement une séquence d'ADN (UASG pour upstream activated sequence for the yeast Gal genes).
- un domaine C-terminal contenant une région acide. Les charges négatives participent à l'activation transcriptionnelle.
Quand le facteur de transcription GAL4 se lie, il active la transcription du gène reporteur.
Plus la charge négative est grande, et meilleure est l'activité transcriptionnelle.
La structure du domaine d'activation acide(AAD).
Des analyses génétiques sur le domaine d'activation acide(AAD) de la protéine GAL4 de la levure ont permis de montrer qu'il possède une structure constituée de brins b.
Le complexe AAD/TBP.
Le complexe, formé du domaine activateur acide (AAD) de GAL4 de la levure et de TBP, est composé de 2 molécules de AAD et d'une molécule de TBP.
De plus, les ADN contenant la boîte TATA et le domaine activateur acide de GAL4 lient TBP compétitivement; le domaine AD et la boîte TATA reconnaissent des surfaces chevauchantes de TBP.
Sous l'effet des interactions entre GAL4 et l'ARN polymérase, ou de protéine se liant à la boîte TATA comme TBP, l'ADN se recourbe et forme une grande boucle. GAL4 peut ainsi moduler l'activité de l'ARN pol.
Pour plus d'information sur la courbure des ADN, voir le site suivant:
http://www.imb-jena.de/
Le domaine N-terminal de GAL4 est essentiel pour la fixation à l'ADN.
Le domaine de liaison à l'ADN de GAL4 chez la levure est localisé au niveau des 60 résidus formant la région N-terminale du polypeptide(881aa au total). La technique RMN à deux dimension a été utilisée pour déterminer la structure d'un fragment N-terminal de GAL4(résidus 1-65).
Ce fragment, monomérique en solution (fig.1), lie spécifiquement la séquence UASG de l'ADN, puis dimérise une fois fixé (fig.2a) (2).
fig.1 Structure 3D de la protéine GAL4 monomérique.
La protéine possède 3 hélices a: H1, H2, H3. |
fig.2a Structure 3D de la protéine GAL4 dimérique, complexée à 19pb de l'ADN. VUE DE FACE
Chaque chaîne protéique A et B du dimère possède respectivement 3 hélices a: H1A, H2A, H3A, et H1B, H2B, H3B.
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fig.2b Structure 3D de la protéine GAL4 dimérique, complexée à 19pb de l'ADN. VUE DE DESSUS
Chaque triplet CGG est distant l'un de l'autre de 48,71A°.
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Le facteur de transcription appelé GAL4 de la levure contient dans sa partie N-terminale de liaison à l'ADN une séquence Cys(6) d'acide aminé contenant 6 résidus cystéine (3) :
Cys11-X2-Cys14-X6-Cys21-X6-Cys28-X2-Cys31-X6-Cys38.
Ces 6 résidus cystéine vont former un assemblage dinuclé avec soit 2 ions zinc, soit 2 ions cadmium Cd (la détermination a été faite uniquement pour les ions Cd) (fig.3 et fig.4).
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fig.3 Le domaine N-terminal de liaison à l'ADN de GAL4 lie 2 ions Cd.
Ce domaine, Cys11-X2-Cys14-X6-Cys21-X6-Cys28-X2-Cys31-X6-Cys38, fixant les 2 ions Cadmium, Cd1, et Cd2, forme un assemblage dinucléé Cd2Cys6. | fig.4 Deux hélices empaquettent le groupe Cd2Cys6.
Les deux hélices H1B et H2B enveloppent les ions
Cd1 et Cd2, donnant une forme globulaire à la structure. |
La fixation des deux ions zinc ou des deux ions Cadmium au domaine de liaison à l'ADN de GAL4 (fig.5 et fig.6)est indispensable pour induire un changement de conformation de GAL4 (3) qui se fixe à la séquence spécifique de l'ADN, UASG.
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fig.5 Conformation du domaine N-terminal de GAL4,
avant la fixation des ions Cd .
Les résidus 9-40 forme un groupe globulaire compact. |
fig.6 Conformation du domaine N-terminal de GAL4,
après la fixation des 2 ions Cd.
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fig.7 Superposition des structures 3D des domaines N-terminal
sans fixation de l'ion Cd (en bleu), et avec fixation de l'ion Cd (en vert).
Les chiffres indiquent la distance séparant 2 atomes identiques dans les 2 conformations.
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L'assemblage Cd(2)Cys(6) de GAL4 reconnait une séquence spécifique de l'ADN(17pb); mais ce n'est en fait que le palindrome CGG situé à la fin des 17pb du site de reconnaissance qui est essentiel pour lier efficacement, l'identité des 11pb internes étant beaucoup moins importantes.
Les 2 domaines de reconnaissance de l'ADN de 2 molécules GAL4 vont reconnaitre la séquence spécifique de l'ADN et vont se fixer chacune sur un triplet CGG (la distance séparant les 2 triplets CGG de l'ADN est donnée sur la fig.2b).
La protéine GAL4, contenant un élément de dimérisation en superenroulement, lie alors symétriquement l'ADN sous forme d'homodimère.
Les hélices de dimérisation s'associent pour former un segment court d'hélices enroulées parallèles dans lequel la région en contact entre les hélices composant les hélices enroulées est stabilisées par hydrophobicité grâce aux trois paires de résidus Leu (Leu49, 54, et 61) et à une paire de résidus Val (Val 57)(une organisation similaire à ce qui est appelée fermeture éclair à leucine, "leucine zipper"). L'hélice superenroulée est positionnée sur le petit sillon de l'ADN.
La technique double hybride.
Le modèle.
Le système double hybride (fig.8) permet d'identifier une interaction protéine-protéine in vivo par reconstitution d'un activateur de l'activité transcriptionnelle (4).
La méthode, basée sur les propriétés de la protéine GAL4 trouvé chez la levure Saccharomyces Cerevisiae, consiste en la séparation de domaine responsable de la liaison à l'ADN et de l'activité transcriptionnelle.
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fig.8 Stratégie de détection des interactions entre protéines par le système double hybride.
Les plasmides codant pour deux protéines hybrides, une représentant le domaine de GAL4 liant l'ADN fusionné à la protéine X (1), et l'autre représentant le domaine de GAL4 activateur de la transcription, fusionné à la protéine Y (2), sont construits et introduits à l'intérieur de la levure.
L'interaction entre les deux protéines X et Y conduisent à la reconstitution d'une protéine GAL4 fonctionnelle(3) et donc à l'activation de la transcription du gène reporteur contenant un site de liaison à GAL4.
La protéine associé au domaine de liaison à l'ADN est appelé "appât". L'appât est généralement une protéine dont on recherche les partenairs cellulaires.
La protéine associé au domaine activateur de la transcription est appelé "proie". La proie est souvent inconnue. Les éléments d'une banque issue d'un type cellulaire donné, est couplé au gène du domaine terminal de GAL4 pour identification des proies.
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Le gène reporteur le plus utilisé est le gène lacZ, qui code pour une enzyme, la b-galactosidase.
L'expression de lacZ peut-être mesurée par un colorimètre, selon le test de l'a complémentation des levures basée sur l'activité de la b-galactosidase.
Avantages de la technique double hybride.
Avec cette méthode, les interactions décelées in vivo permettent de détecter des interactions de faible affinité.
Inconvénients de la technique double hybride.
Cette méthode donne de nombreux faux positifs, ce qui peut par conséquent fausser complètement les résultats. De plus, elle est difficilement réalisable en ce qui concerne les protéines membranaires.
Applications pour ce modèle double hybride.
Il permet:
- de mettre en évidence les interactions protéine-protéine;
- d'identifier les mutations qui affectent les liaisons;
- d'identifier les domaines de la protéine impliqués dans la liaison;
- d'identifier de nouveaux partenaires.
Les nouvelles applications.
- la réverse double hybride; elle permet de détecter les dissociations protéine-protéine et les interactions ADN-protéine;
- la méthode triple hybride (fig.9);
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fig.9 Stratégie de détection des interactions entre protéines par le système triple hybride (5).
Dans cette méthode triple hybride, l'interaction entre l'appât et la proie est contrôlée et dépend de l'expression d'une troisième protéine, appelée protéine de liaison (Z).
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Visualisation 
avec Chemscape Chime
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Références
(1) Fields S., Song O. : A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 1989, 340 : 245-246
(2) Gadhavi PL : DNA binding domain of the yeast transcriptional activator GAL4. FEBS Lett 1997, 94 : 6042-6047
(3) Gardner KH, Pan T, Narula S, Rivera E, Coloeman JE. : Structure of the binuclear metal-binding site in the GAL4 transcription factor. Biochemistry 1991, 30 : 11292-11302
(4) Chien, Bartel, Sternglanz, Fields : Yeast two hybrid mapping. PNAS 1991, 88 : 9578-9582
(5) Emma Warbrick : Tow's company, three's a crowd: the yeast two hybrid system for mapping molecular interactions.. Structure 1997, 5 : 13-17
